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常見的PCR反應抑制物一覽

日期:2020-12-09

常見的PCR反應抑制物一覽

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一個PCR反應過程分為很多的步驟,同時也受到很多因素的影響,可以分為內(nèi)部因素和外部因素,內(nèi)部因素是指正常試劑體系中的成分,外部因素是指環(huán)境或者樣本帶入的因素。



體系內(nèi)部因素


引物:引物是整個PCR體系最重要的部分,也是決定一個PCR反應特異性的關鍵,引物在設計時要遵守一定的原則(長度、擴增跨度、堿基等)。
酶及其濃度:目前有兩種Taq DNA聚合酶,一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶,另一種為大腸桿菌合成的基因工程酶,酶濃度過高可引起非特異性擴增,濃度過低則合成產(chǎn)物量減少。
dNTP質(zhì)量與濃度:dNTP溶液呈酸性,一般配置成體系需將其調(diào)節(jié)至7.0-7.5,正常情況下4種dNTP的濃度應該相等,如果其中某一種過高就會引起錯配,濃度過低又會引起PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量。
模板核酸(靶標):模板核酸的量和純化程度,是PCR成敗與否的關鍵環(huán)節(jié)之一,對于RNA模板更要注意RNA的降解。
Mg2+濃度:主要影響PCR擴增的特異性和產(chǎn)量,一般要對應dNTP的濃度。Mg2+濃度過高,反應特異性降低,出現(xiàn)非特異性擴增,濃度過低會降低Taq DNA聚合酶的活性,使反應產(chǎn)物減少。
溫度與時間的設置:PCR原理三步驟涉及變性-退火-延伸三個溫度點,也就是變性溫度與時間、退火(復性)溫度與時間、延伸溫度與時間。
循環(huán)次數(shù):循環(huán)次數(shù)決定PCR擴增程度,PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度。一般溫度循環(huán)次數(shù)在30-40次之間,循環(huán)次數(shù)越多,非特異性產(chǎn)物的量就越多。



體系外部因素


  • SDS:離子去污劑,0.01%即可完全抑制PCR反應,0.005%可顯著降低產(chǎn)量
  • 苯酚:0.5%即可完全抑制PCR反應,0.2%可顯著降低產(chǎn)量
  • 乙醇:大于1%的濃度可抑制PCR反應,但在某些體系里又能增加產(chǎn)量
  • 異丙醇:抑制作用比乙醇稍強
  • 乙酸鈉:大于5mM時抑制PCR反應
  • 氯化鈉:大于25mM時抑制PCR反應(生理鹽水無影響)
  • EDTA:0.5mM可使PCR產(chǎn)物減少,1mM完全沒有PCR產(chǎn)物
  • 血紅素(heme)-來源:血液,大于1mg/ml抑制PCR反應
  • 氯高鐵血紅素(hemin):大于0.1ng/μl抑制PCR反應
  • 丹寧酸(tannic acids):大于0.1ng/μl抑制PCR反應
  • 肝素:大于0.15IU/ml抑制PCR反應
  • 尿素-來源:尿,大于20mM時產(chǎn)生抑制
  • 腐殖質(zhì)-來源:土壤,植物材料,自然界水
  • 植物多糖-來源:糞便,植物多糖
  • 聚苯乙烯,聚丙烯-來源:紫外線照射塑料管
  • 膽酸鹽-來源:糞便
  • 膠原質(zhì)-來源:組織
  • 靛青染料-來源:粗斜紋棉布,牛仔褲
  • 蛋白酶-來源:牛奶
  • 鈣離子-來源:牛奶,骨頭
  • 鐵離子-來源:血液
  • 二甲苯胺
  • 溴酚蘭
  • 膽紅素(bilirubin)
  • 其他抑制劑


除上述抑制劑外,還存在一定的PCR增強劑,比如甜菜堿、二甲基亞砜、甲酰胺、甘油、PEG、亞精胺和單鏈DNA結(jié)合蛋白等,但是在高濃度情況下,也會對PCR產(chǎn)生抑制,因此如何采用增強劑消除抑制劑的影響,采用多少的濃度對結(jié)果都存在很大的影響。



臨床PCR常見問題


1

假陽性問題

方法學問題:靶基因序列特異性、引物錯配、非特異性擴增污染問題:樣本污染、產(chǎn)物污染、產(chǎn)物污染解決辦法:嚴格區(qū)分試驗區(qū)域及人員培訓,使用UNG技術


2

假陰性問題

問題來源:試劑因素、操作因素、儀器因素、標本因素解決辦法:設置陽性對照監(jiān)測試劑問題降低操作難度,提高操作人員水平室內(nèi)質(zhì)控、室間質(zhì)控監(jiān)控使用抗干擾能力強的試劑提取樣本
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