受理號：CSZ1900370
體外診斷試劑產品注冊技術審評報告
產品中文名稱：SHOX2/RASSF1A/PTGER4 基因甲基化檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）?
產品管理類別：第三類?
申請人名 稱：北京艾克倫醫療科技有限公司
國家藥品監督管理局
醫療器械技術審評中心
基本信息
一、申請人名稱 北京艾克倫醫療科技有限公司
二、申請人住所 北京市昌平區科技園區白浮泉路10號2號樓北控科技大廈3層302室?
三、生產地址 北京市昌平區科技園區白浮泉路10號2號樓北控科技大廈3層302室、北京市昌平區超前路37號1幢4層5-4-2-01
技術審評概述
一、產品概述?
（一）產品主要組成成分 產品主要組成成分見下表：
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（二）產品預期用途
本試劑盒用于體外檢測人外周血血漿中SHOX2、RASSF1A、PTGER4基因的甲基化。
本產品用于臨床上對疑似肺癌患者的輔助診斷，檢測結果陽性不作為肺癌早期診斷或確診的證據，檢測結果陰性也不能排除肺癌的可能。該檢測不能作為腫瘤早期診斷或確診的依據，不宜用于普通人群的腫瘤篩查。SHOX2 屬于 SHOX 基因家族，在胚胎形成期對骨骼、心臟和神經系統的發育作用重大，在肺癌、乳腺癌和腎癌中異常表達。RASSF1A 調控涉及基因轉錄、信號轉導、細胞周期、細胞凋亡等多種生物學功能，可以通過多種途徑抑制腫瘤形成。PTGER4 屬于 G 蛋白偶聯受體家族，是非常重要的抑癌基因。研究發現，肺癌患者血漿樣本中 SHOX2、RASSF1A 及 PTGER4三基因啟動子區域呈高度甲基化。
（三）產品包裝規格
30 人份/盒。
（四）產品檢驗原理
提取血漿中的游離 DNA，然后用亞硫酸鹽轉化未發生甲基化的胞嘧啶，通過脫氨基反應產生尿嘧啶磺酸鹽，發生甲基化的胞嘧啶則不會被亞硫酸鹽轉化。將亞硫酸鹽轉化的 DNA（BisDNA）做多重 PCR 擴增，PCR 反應中的引物、探針能區分甲基化和非甲基化序列，甲基化序列優先得到擴增，與甲基化 SHOX2、RASSF1A、PTGER4 基因序列特異性結合的熒光素探針可以在 PCR 反應中專一地檢測出甲基化序列。內參對照ACTB（β-actin）基因用于評估檢測中 DNA 量是否足夠。
二、臨床前研究概述
（一）主要原材料
1.主要原材料的選擇
本產品的主要原材料包括引物干粉、PCR反應液、人類基因組DNA和Hela細胞基因組DNA。這些原料均是通過外購的方式獲得。
其中引物的序列均由申請人自行設計，由合成公司經過合成、修飾、純化方式獲得；PCR反應液由供應商化學合成獲得；人類基因組DNA和Hela細胞基因組DNA由供應商提取純化獲得。
申請人對主要原材料進行了供應商的選擇，通過功能性實驗篩選出合格供應商，制定了各主要原材料的技術要求和質量標準并經檢驗合格。
2.企業參考品設置情況
本產品企業參考品包括陽性參考品、陰性參考品、精密度參考品以及檢測限參考品，組成如下：
陽性參考品包括 12種。P1、P2、P3為一定 DNA 濃度下SHOX2、RASSF1A、PTGER4 三基因均為甲基化的不同甲基化比例的參考品；SP1、SP2、SP3為一定 DNA 濃度不同比例的SHOX2單甲基化參考品；RP1、RP2、RP3為一定 DNA 濃度不同比例的RASSF1A單甲基化參考品；PP1、PP2和PP3為一定DNA 濃度不同比例的PTGER4單甲基化參考品。陰性參考品包括 4種，包括三種不同DNA濃度下SHOX2、RASSF1A、PTGER4均無甲基化的參考品，一種三基因均甲基化但甲基化比例低于檢測限的陰性參考品。精密度參考品包括6種。J1、J2為一定DNA 濃度，SHOX2、RASSF1A、PTGER4 三基因均甲基化，且甲基化程度高低不同的兩種精密度參考品。SJ1、SJ2為一定DNA 濃度，SHOX2單基因甲基化，且甲基化程度高低不同的兩種精密度參考品。RJ1、RJ2為一定DNA 濃度，RASSF1A單基因甲基化，且甲基化程度高低不同的兩種精密度參考品。PJ1、PJ2 為一定DNA 濃度，PTGER4基因單甲基化，且甲基化程度高低不同的兩種精密度參考品。
檢測限參考品包括 4 種。包括低 DNA 濃度的 SHOX2、RASSF1A、PTGER4三基因甲基化參考品，低 DNA 濃度的SHOX2單基因甲基化參考品，低 DNA 濃度的RASSF1A單基因甲基化參考品，低 DNA 濃度的 PTGER4單基因甲基化參考品。
（二）生產工藝及反應體系研究
申請人對試劑盒反應體系的研究中包括引物探針濃度的確定、PCR 反應液的選擇、陰/陽性質控品配方的確定等；對PCR過程中的退火溫度進行研究；完成樣本的用量以及樣本保存時間 的 研 究 ；對 該 產 品 三 種 適 用 機 型 宏 石 PCR 分 析 系 統SLAN-96P、Applied Biosystems 7500，Roche Lightcycler 480的反應程序及分析條件進行了研究。
通過功能性實驗，最終確定了最佳的反應體系。申請人根據試劑盒中試劑及組件的主要生產工藝的研究結果，確定了最佳的生產工藝。
（三）分析性能評估
本產品分析性能評估內容包括：準確性（陽性符合率、陰性符合率）、精密度、檢測限、分析特異性的評估；核酸提取試劑的性能評估；三種適用的 PCR 儀機型（宏石 PCR 分析系統SLAN-96P、Applied Biosystems 7500，Roche Lightcycler 480）評估。
準確性研究使用企業陰/陽性參考品及臨床樣本來源的陰性/陽性/弱陽性樣本池分別對三個批次的試劑盒進行檢測，檢測結果顯示陽性符合率 100%、陰性符合率 100%。同時用試劑盒與同類對比試劑分別檢測臨床樣本，包括各期肺癌樣本共 128 例及肺結核樣本 32 例，結果顯示試劑盒對于Ⅰ~Ⅳ期肺癌和肺結核樣本監測的準確率分別為 78.13%、87.50%、84.38%、87.50%和81.25%。
精密度的研究使用了兩種不同的樣本，第一種樣本是精密度參考品，對三批次試劑盒分別在三種適用的儀器上進行檢測。
檢測結果顯示試劑盒檢測的 SHOX2、RASSF1A、PTGER4 和ACTB 基因的變異系數均小于 10%。第二種樣本是通過在臨床正常人血漿樣本中添加一定濃度的細胞系 DNA 模擬精密度企業參考品進行驗證，檢測結果顯示 SHOX2、RASSF1A、PTGER4和 ACTB 基因的變異系數均小于 10%。同時也對配套用核酸提取試劑的精密度進行了研究，結果表明在樣本采集過程、核酸提取過程中 DNA 提取量變異系數小于 10%；核酸轉化過程中，ACTB 基因 Ct 值的變異系數均小于 10%。檢測限研究，以陰性血漿樣本為基質，對不同游離 DNA 濃度下含有不同比例甲基化 DNA 的血漿樣本進行檢測，得到血漿樣本的檢測限，并在三種適用機型上進行驗證。結果表明試劑盒可檢測血漿中陽性 DNA 最低濃度為 0.1pg/?L。在血漿 DNA濃度為 0.02ng/?L 時，產品檢測 P 值為陽性的檢測限為 0.5%三基因甲基化，單基因甲基化的檢測限分別為 0.2%的 SHOX2 甲基化，0.5%的 RASSF1A 甲基化和 0.2%的 PTGER4 甲基化。使用三批試劑盒對四種檢測限參考品進行檢測驗證，結果表明對于DNA濃度為0.02ng/?L的參考品，P值為陽性的檢測限為0.5%的三基因甲基化，單基因甲基化的檢測限分別為 0.2%的 SHOX2甲基化，0.5%的 RASSF1A 甲基化和 0.2%的 PTGER4 甲基化。特異性研究，交叉反應實驗結果表明試劑盒檢測干擾樣本的綜合特異性超過 85%。對于發生肺轉移的其它原發癌癥（包括肝癌、胃癌、胰腺癌、乳腺癌、食管癌、結直腸癌）檢出率較低，假陽性率低于 25%，說明產品僅適用于原發性肺癌的檢測。檢測自身免疫性疾病包括紅斑狼瘡和類風濕性關節炎的特異性超過 90%，假陽性率低于 10%。檢測其它肺部疾病的特異性超過 85%，假陽性率低于 15%。檢測宮頸癌特異性為 80%，假陽性率為 20%。
干擾實驗顯示，樣本中含有以下干擾物：未甲基化 DNA（150ng/ml）、膽紅素（0.20mg/ml）、血紅蛋白（10mg/ml）、甘油三酯（12mg/ml）、蛋白（血清白蛋白，120mg/ml）、紅細胞（0.4% v/v）、K2EDTA（20mg/ml）、膽固醇（5mg/ml）、尿酸（0.235mg/ml）和葡萄糖（10mg/ml），對檢測結果無影響。常見治療藥物，包括感冒藥、消炎藥、心腦血管疾病藥、糖尿病藥、胃病藥、維生素、高血壓藥、安定藥、鎮痛藥等在最大使用劑量范圍內，不影響試劑盒對樣本檢測的 Ct 值及 P 值判定。
對與試劑盒聯合使用并在說明書中推薦的血漿樣本處理試劑（核酸提取試劑，京昌械備 20180004 號，北京艾克倫醫療科技有限公司）進行了性能評估，結果表明產品配套使用的核酸提取試劑，提取效率、保護效率和轉化效率分別為 85.18%、93.52%和 99.32%。
對該產品適用的三種儀器宏石 PCR 分析系統 SLAN-96P、Applied Biosystems 7500，Roche Lightcycler 480 進行了性能評估，結果顯示在三種適用機型上的陰/陽性符合率、檢測限、精密度均符合質量要求，可以作為該產品的檢測 PCR 儀。
（四）陽性判斷值研究
申請人采用三基因擬合 P 值公式法確定陽性判斷值。每個樣本進行 3 次 PCR 平行測試，計算 SHOX2、RASSF1A、PTGER4和 ACTB 基因 3 個復孔平均 Ct 值，其中各個基因無擴增時，Ct值定義為 45.0。ACTB 基因的 Ct 值≤35.0 時，樣本檢測結果有效。在確定樣本檢測結果有效的情況下，樣本 P 值≥2.0 則判斷樣本為陽性，樣本 P 值＜2.0 則判斷樣本為陰性。
陽性判斷值研究入組（訓練集和驗證集）有效樣本數共計489 例，包括肺部正常樣本 207 例、肺癌病人樣本 141 例、其它干擾樣本（包括結節、肺炎、肺結核、囊腫、食管癌、胃癌等）141 例。樣本數據進行多種方法統計分析，包括 1/3 次 PCR 反應 Ct 值、2/3 次 PCR 反應 Ct 值、3/3 次 PCR 反應 Ct 值、3 次PCR 反應平均 Ct 值、單基因、兩基因、三基因、三基因組合擬合公式等，比較不同分析方法的檢測靈敏度、特異性、總符合率，最終確定使用三基因擬合 P 值公式法檢測準確率最高。并使用測試集樣本再次驗證三基因擬合公式和其他陽性判斷值方法，測試集研究入組有效例數 248 例，包括肺部正常人樣本 81例，肺癌病人樣本 76 例，其他干擾樣本 91 例。結果表明三基因擬合 P 值公式法特異性為 94.19%（95%CI：90.65%-97.72%），靈敏度為 89.47%（95%CI：82.41%-96.53%），總符合率為 92.74%（95%CI：89.49%-95.99%）。
（五）穩定性研究
申請人對該產品的穩定性的研究包括長期穩定性、使用穩定性（包括開瓶穩定性、凍融穩定性和熱穩定性）及樣本穩定性（包括全血、血漿及 BisDNA 的穩定性）。長期穩定性：選擇三批次試劑盒置于-20±5℃冰箱中保存，在儲存后的第 0、3、6、9、12、13、14、15 個月進行檢測，結果顯示產品在生產后 15 個月的產品性能符合技術要求，試劑性能穩定。確定產品有效期可達 12 個月。
使用穩定性：將三批試劑盒置于-20±5℃開瓶放置 6 周后，穩定性結果 P 值及 CV 值均無顯著差異，無顯著變化趨勢，其產品的主要性能均符合技術要求。將三批次試劑盒在規定的儲存條件下，取出試劑盒反復凍融 6 次，檢測每次凍融后的試劑盒的性能均符合技術要求。將三批試劑盒置于 37℃，分別于 1天、2 天、3 天后檢測產品性能，均符合技術要求。申請人對全血樣本、血漿樣本及 BisDNA 的樣本穩定性進行了研究，研究結果表明使用 EDTA 抗凝管（BDVacutainer?，6mL，國械注進 20152222083）采集全血，建議選用 2-8℃放置4 小時以內的新鮮血樣分離血漿后用于檢測；使用康為游離DNA 采血管（康為世紀，5mL，蘇械注準 20192220059）采集全血，建議選用室溫放置 4 天以內的血樣分離血漿后用于檢測。分離后的血漿樣本建議在-20±5℃保存 30 天以內，在 2-8℃保存12 小時以內進行檢測；BisDNA 保存期限為在-20±5℃保存 4 天以內，在 2~8℃保存 16 小時以內進行 PCR 檢測。
三、臨床評價概述
本產品在上海市東方醫院、山西省腫瘤醫院和河南省腫瘤醫院三家臨床試驗機構進行臨床試驗，采用試驗體外診斷試劑與臨床參考標準進行比較研究，確認本產品的臨床性能。其中，肺癌和其他腫瘤病例采用病理診斷確診，其他疾病根據相關診療指南采用病理診斷或 CT 等綜合診斷確診。入組病例為肺癌疑似病例，樣本類型為血漿。產品臨床靈敏度和特異度評價共納入臨床病例 1303 例，其中肺癌病例 486 例（覆蓋肺癌所有分期及所有病理分型），非肺癌的其他病例 817 例（包括其他易產生干擾的腫瘤及各種良性疾病病例）。試驗結果顯示：本產品臨床靈敏度為 86.83%（95%CI：83.53%～89.55%），特異度 95.59%（95%CI：93.96%～96.80%），總符合率為 92.33% （95%CI：90.75%～93.65%） 。上述結果顯示試驗體外診斷試劑具有較好的臨床靈敏度和特異度，滿足臨床使用需求。?
此外，臨床試驗還納入 260 例肺癌疑似病例（包括本產品與臨床參考標準檢測結果不符樣本），采用試驗體外診斷試劑與一代測序進行比較研究，確認本產品的臨床檢測性能。試驗結
果顯示：針對 SHOX2 基因，陽性符合率為 100%（95%CI：97.37%～100%），陰性符合率為 98.31%（95%CI：94.03%～99.53%），總符合率為 99.23%（95%CI：97.24%～99.79%）；針對 RASSF1A 基因，陽性符合率為 100%（95%CI：97.24%～100%），陰性符合率為 98.28%（95%CI：93.93%～99.53%），總符合率為 99.23%（95%CI：97.24%～99.79%）；針對 PTGER4基因，陽性符合率為 100%（95%CI：96.97%～100%），陰性符合率為 98.54%（95%CI：94.83%～99.60%），總符合率為 99.23%（95%CI：97.24%～99.79%）。上述結果顯示兩者之間具有良好的一致性，本產品臨床檢測性能滿足要求。?
另外，采用試驗體外診斷試劑對 37 例肺癌患者手術前后的樣本進行連續檢測，35 例樣本術前檢測結果為陽性，術后檢測結果為陰性；2 例樣本術前術后檢測結果均為陰性，表明肺癌手術切除后血漿中甲基化水平降低。
綜上所述，臨床試驗結果顯示本產品的臨床性能滿足技術審評要求。
四、產品受益風險判定
根據申請人提供的申報資料，經綜合評價，在目前認知水平上，認為該產品上市帶來的受益大于風險。但為保證用械安全，基于對主要剩余風險的規避，需要在說明書中提示以下信息：
1.使用普通 EDTA 真空采血管采集后的血樣應立即分離血漿，若不能立即分離血漿，應在 2~8℃保存，保存時間不超過 4小時；使用游離 DNA 采血管采集后的血漿可以室溫保存 4 天。不得冰凍血樣。
2.禁止使用離心機剎車（急停）功能，以防止破壞血細胞層。
3.制備好的血漿樣本可以在-20±5℃下保存不超過 30 天可以在 2~8℃存放不超過 12 小時。
4.BisDNA 不立即使用，可在 2~8℃保存 16 小時，或在-20±5℃保存 4 天。
5.PCR 反應液和引物混合液使用完畢立即復凍。
6.密封后的 PCR 管可在 2~8℃放置不超過 2 小時。
7.只能用于體外診斷。
8.該產品的有效性僅針對于 EDTA 抗凝采血管。對于其它血樣的收集方式有效性沒有做測試。
9.該產品的使用者應該是接受過 PCR 反應訓練的試驗者。
10.由于肺癌檢測依賴于樣品中腫瘤 DNA 的量，所以可能受樣品收集過程、樣品儲存方式、病人個體因素（如年齡，其它疾病）以及腫瘤級別影響，外周血的采集、血漿的制備和存儲均應按照要求進行，否則將影響檢測結果，導致假陰性的檢測結果。
11.由于血漿樣本中游離 DNA 含量低、易降解，應嚴格按照【樣本要求】的規定處理和保存樣本，否則影響檢測，造成假陰性結果。
12.由于擴增的初始靶 DNA 含量極低，故擴增循環數較長。應盡量避免檢測環境的污染，否則容易在擴增循環末期產生假陽性信號。
綜合評價意見
本申報項目為境內第三類體外診斷試劑產品注冊，屬于境內同品種首個產品。申請人的注冊申報資料符合現行要求，依據《醫療器械監督管理條例》（國務院令第 680 號）、《體外診斷試劑注冊管理辦法》（國家食品藥品監督管理總局令 2014 年第 5號）等相關醫療器械法規與配套規章，經系統評價后，建議準予注冊。
2022 年 1 月 29 日
