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【CMDE】乙型肝炎病毒RNA（HBV-RNA）測定試劑盒（PCR-熒光探針法）注冊技術審評報告公開

日期:2022-12-15

受理號：CSZ1900206

體外診斷試劑產品注冊技術審評報告

產品中文名稱：乙型肝炎病毒 RNA（HBV-RNA）測定試劑盒（PCR-熒光探針法）

產品管理類別：第三類

申請人名稱：北京熱景生物技術股份有限公司

國家藥品監督管理局

醫療器械技術審評中心

基本信息

一、申請人名稱

北京熱景生物技術股份有限公司

二、申請人住所

北京市大興區中關村科技園區大興生物醫藥產業基地天富街?9?號?9?幢

三、生產地址

北京市大興區中關村科技園區大興生物醫藥產業基地天富街?9?號?9?幢

技術審評概述

一、產品概述

(一)?產品主要組成成分

本試劑盒由?A?盒（磁珠法核酸提取試劑）和?B?盒（擴增反應試劑）組成，主要組成成分見表1。

具體內容詳見產品說明書。

（二）產品預期用途

本試劑盒用于體外定量測定人血清樣本中的乙型肝炎病毒 RNA（HBV-RNA）。

已有研究數據顯示，外周血血清中 HBV-RNA 可反映肝內 HBV 病毒的轉錄活性，在部分血清中HBV DNA 低于檢測下限的樣本中，HBV-RNA 仍可以被檢測到。同時，在NAs治療中，血清HBV-RNA 可輔助作為 HBeAg 轉陰的預測的指標之一，血清 HBV-RNA 結果為陰性，需要結合其他指標共同用于指導 NAs 的治療。該檢測結果不得作為患者病情評價的唯一指標，必須結合患者臨床表現和其他實驗室檢測對病情進行綜合分析。本試劑盒不得用于 HBV 的血液篩查。

（三）產品包裝規格

48 人份/盒。

（四）產品檢驗原理

本試劑盒（PCR-熒光探針法）采用磁珠法提取血清中的 HBV-RNA。特異性地檢測 HBV-RNA 的保守區域。檢測試劑內含有一條反轉錄引物、一對特異性擴增引物以及一條熒光探針，與 RT-PCR 反應緩沖液，Taq 酶，逆轉錄酶等共同配制成 RT-PCR 反應液，在實時熒光定量 PCR 儀上進行一步法 RT-PCR 擴增，實現對血清樣本中 HBV-RNA 的檢測。

二、?臨床前研究概述

(一)?主要原材料

1. 主要原材料的選擇

本產品的主要原材料包括：引物、探針、假病毒、RT-PCR 反應體系（包括 10×RT-PCR Buffer（含 dNTPs）、逆轉錄酶和 TaqDNA 聚合酶混合液）、磁珠法核酸提取試劑等，這些原材料均是通過外購方式獲得。其中，引物和探針均為申請人自行設計，由專業的合成公司合成和純化后獲得。

申請人從有資質的供應商中，通過功能性試驗，篩選出最佳原材料和供應商。制定了各主要原材料質量標準并經檢驗合格。

2.企業參考品設置情況

該產品企業參考品包括陽性參考品、陰性參考品、精密度參考品、檢出限參考品、準確度參考品、樣本線性參考品、核酸提取功能參考品，參考品采用臨床樣本制備而成。組成如下：

陽性參考品共 10?份，分別命名為陽性參考品 P1~P10，來源于 HBV-RNA 陽性樣本，涵蓋B型、C型和D型。

陰性參考品共10份，分別命名為陰性參考品?N1~N10，涵蓋正常人樣本、巨細胞病毒、EB病毒、人類免疫缺陷病毒1型、丙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒和梅毒樣本。

精密度參考品共 2 份，分別命名為精密度參考品 J1~J2，采用 HBV-RNA 陽性樣本梯度稀釋而成。

檢出限參考品?1?份，命名為檢出限參考品?S1，采用?HBV-RNA 陽性樣本稀釋而成，濃度為 300copies/mL 。

準確度參考品共 5 份，分別命名為準確度參考品 Y1~Y5，采用 HBV-RNA 陽性樣本梯度稀釋而成，濃度分別為2.0×107copies/mL、 2.0×106copies/mL 、2.0×105copies/mL 、2.0×104copies/mL、2.0×103copies/mL。

樣本線性參考品 1 份，命名為樣本線性參考品 L，采用 HBV-RNA 陽性樣本稀釋而成。

核酸提取功能參考品共 12 份，分別命名為核酸提取功能參考品 T1~T12，其中 T1~T8 采用含內源性干擾物質的 HBV- RNA 陽性樣本稀釋而成，T1、T5、T9 含血紅蛋白，T2、T6、 T10?含甘油三脂，T3、T7、T11 含總 IgG，T4、T8、T12 含?總膽紅素，T9~T12 為陰性血清樣本。

以上臨床樣本采用數字 PCR 法和實時熒光 PCR 法進行確認。各企業參考品用于產品準確性、特異性、檢出限、精密度、線性、核酸提取功能等的檢測。

本試劑盒設置了陽性質控品和陰性質控品，用于檢測過程中試劑盒和儀器的質量控制。此外，每個樣本均檢測 1 個?內標，用于評估核酸提取和 PCR 擴增的質量和結果的判讀。

(二)生產工藝及反應體系研究

申請人對試劑盒反應體系的研究包括對 HBV-RNA?特異性引物/探針濃度的確定、內標引物/探針濃度的確定、反應液的選擇、反應體積的確定、核酸提取試劑的確定、DNA 酶 I 的用量確定等；對反應條件的研究包括 PCR 退火溫度、擴增循環數、擴增反應時間，DNA 酶 I 的作用溫度和時間的篩選和優化；對樣本用量、內標用量、核酸提取液體積等進行了研究。

申請人通過功能性實驗，確定了最佳的反應體系。并根據試劑盒中試劑及組件的主要生產工藝的研究結果，確定了最佳的生產工藝。

（三）分析性能評估

該產品分析性能評估內容包括核酸提取功能、檢出限、線性范圍、準確度、精密度、分析特異性（交叉反應、干擾物質）、HBV DNA 干擾濃度等。申請人提交了有效運行的質量管理體系下生產的三批產品在 3 種適用機型（ ABI Prism7500、LightCycler480、杭州博日 9600plus）上的性能評估資料。

在核酸提取功能評估中，申請人使用含有 28mg/dL 總膽紅素、22g/dL 血紅蛋白、3000mg/dL 甘油三酯、40g/L 總 IgG 的 HBV-RNA 陰性血清樣本稀釋已知濃度的HBV-RNA 強陽性樣本，制備成高、低濃度樣本進行研究，結果表明以上干擾物質對核酸提取性能無影響。

在檢出限的性能評估中，申請人對 HBV-RNA?臨床血清樣本（B 型、C 型、D 型）和 HBV-RNA 假病毒樣本（A 型、E 型、F ?型、G 型）進行梯度稀釋，采用三批次試劑對系列濃度樣本分別進行 20?次重復檢測，以≥95%陽性檢出率的最低稀釋濃度作為檢出限，最終確定該產品檢出限為 300copies/mL。采用三批試劑對 HBV-RNA 臨床血清樣本（B 型、C 型、D 型）和 HBV-RNA 假病毒樣本（A 型、E 型、F 型、G型）進行檢出限的重復性檢測驗證，符合檢出限的性能要求。

在線性范圍的性能評估中，申請人采用不同基因型的樣本，分別制備?9?個濃度的樣本進行線性范圍研究，產品在1.0×103copies/mL~1.0×108copies/mL 范圍濃度呈線性相關，線性相關系數 r＞0.9800，符合線性范圍的性能要求。

在準確度的性能評估中，申請人采用?HBV-RNA?陰性樣本對陽性樣本進行系列稀釋，分別制備成?2.0×107?copies/mL、2.0?× 106 copies/mL 、2.0?× 105 copies/mL 、2.0?× 104 copies/mL、2.0×103 copies/mL 共 5 個梯度樣本進行準確度研究，結果表明檢測濃度的對數值與理論濃度的對數值的絕對偏差不超過±0.5個對數數量級，符合準確度的性能要求。

在精密度的性能評估中，申請人對高、中?2 個濃度的?HBV-?RNA?精密度樣本進行檢測，分別對批內、批間檢測結果進行分析，結果表明精密度樣本的變異系數均不高于5%，符合精密度的性能要求。

分析特異性研究包含交叉反應和干擾研究。交叉反應的性能評估中，申請人對人巨細胞病毒、EB 病毒、人類免疫缺陷病毒、丙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒、梅毒、人類皰疹病毒 6 型、單純皰疹病毒 1 型、單純皰疹病毒 2 型、甲型流感病毒、丙酸痤瘡桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌樣本進行交叉反應評價。結果顯示，上述樣本與本產品均不產生交叉反應。

干擾研究實驗中，申請人采用在中低濃度的 HBV-RNA 樣本中加入干擾物質的方法進行驗證，拉米夫定（1.3μg/mL）、阿德福韋酯（21.24ng/mL）、恩替卡韋（3.46μg/mL）、替比夫定（3.69μg/mL）、普通 IFNα（2020pg/mL）、聚乙二醇干擾素α（10.88μg/L）、總膽紅素（≤28mg/dL）、甘油三酯（≤3000mg/dL）、血紅蛋白（≤22g/dL）、總 IgG（≤ 40g/L）及不高于 2×107 IU/mL 的 HBV DNA 對本產品檢測結果均不產生干擾。

（四）陽性判斷值或參考區間研究

本產品的陽性判斷值研究，采用乙肝感染者的血清樣本（B 型、C 型、D 型）及不同人的陰性血清樣本共 249 例，使用本試劑盒進行陽性判斷值研究，對檢測靶標 Ct 值進行 ROC 分析，確定其陽性判斷值為靶標 Ct≤26。通過對 HBV?DNA?陽性/陰性、HBsAg?陽性/陰性及?HBeAg?陽性/陰性樣本的靶標進行 Ct 值分析，HBV DNA 陽性/陰性、HBsAg 陽性/陰性及 HBeAg 陽性/陰性對靶標陽性判斷值的判定無影響。

本產品預測 HBeAg 轉陰的陽性判斷值研究，采用 79 例慢性HBV感染者（B 型、C 型、D 型）隊列血清樣本（0?周、48 ?周、5年），使用本試劑盒進行檢測，對檢測結果分別計算 B、C、D 型的 ROC 曲線和最佳預測 cutoff 值，結果顯示?均不具有顯著差異；將 B 型、C 型、D 型樣本合并共同用于確定預測治療 5 年后 e 抗原轉陰的最佳 cutoff 值為 708copies/mL。此時的 PPV 為 81.8%，NPV 為 87.0%。

（五）穩定性研究

申請人對本產品的實時穩定性、開瓶及凍融次數限度穩定性、運輸穩定性進行了研究，同時，對樣本的穩定性也進行了研究，確定了在各種條件下本產品及樣本的有效保存時間。

實時穩定性：將三批次試劑的 A 盒置于 10~30℃，B 盒?置于-20?± 5℃的條件下保存，連續 7 個月對試劑盒的外觀、陰陽性符合率、檢出限、線性、準確度、精密度進行考察，各項性能指標均符合要求，確定產品在規定的儲存條件下，可穩定保存 6 個月。

此外，申請人對產品的開瓶及凍融次數限度穩定性、運輸穩定性和樣本穩定性分別進行了研究。結果顯示，產品的性能均滿足產品說明書聲稱的要求。

三、臨床評價概述

申請人在首都醫科大學附屬北京佑安醫院、蘭州大學第二醫院、沈陽市第六人民醫院共 3家機構完成了臨床試驗，對考核試劑檢測人血清中 HBV-RNA 的臨床準確性和臨床有效性進行驗證。

(一)臨床準確性驗證

采用考核試劑與參比方法對臨床樣本進行比較研究試驗的方法驗證本產品的臨床準確性。入組樣本為慢性 HBV 感染者、其他肝臟疾病干擾樣本以及非肝臟疾病的正常人血清樣本，共計 1033 例。參比方法選擇 ABI QuantStudio 3D芯片數字 PCR 系統。

臨床準確性研究在?3?家臨床單位共檢測了?1033?例血清樣本，實際納入檢測?1033?例，包括慢性?HBV?感染者樣本?709?例（68.64%），其他肝臟疾病干擾樣本?78?例（7.55%），非肝臟疾病的正常人樣本 246 例（23.81%）；675 例有分型結果的樣本中，B 基因型 160?例、C 基因型 464 例、D 基因型 51 例。

對1033例入組血清樣本進行考核試劑和參比方法符合率分析，陽性符合率? 99.26%（95%CI：98.11%~99.80%）、陰性符合率98.99%（95%CI：97.65%~ 99.67%）、總體符合率 99.13%（95%CI：98.35%?~ 99.60%）；Kappa（K）=0.983，考核試劑和參比方法具有較好的一致性。

相關性分析顯示考核試劑和參比方法的線性相關系數 r=0.9864 ，回歸分析得出的線性回歸方程為 y=0.9854x+0.1123，其中截距 a 的 95%的置信區間為[0.0255，0.1992]，斜率 b 的95%的置信區間為[0.9693，1.0015]。

對 675 例有基因分型數據的樣本檢測結果進行分析。B 基因型血清樣本，考核試劑與參比方法定量檢測結果的相?關系數 r=0.9873，線性回歸方程為 y =?0.9973x +?0.0083，截距 a 的 95%置信區間為[-0.1876，0.2042]，斜率 b 的 95%置信區間為[0.9625，1.0321]；C 基因型血清樣本，考核試劑與參比方法定量檢測結果的相關系數 r=0.9853，線性回歸方程為 y =?0.9876x +?0.1229，截距 a 的 95%置信區間為[0.0161，0.2296]，斜率 b 的 95%置信區間為[0.9672，1.0080]；D 基因型血清樣本，考核試劑與參比方法定量檢測結果的相關系數r=0.9918，線性回歸方程為 y = 1.0241x -?0.1546，截距 a 的 95%置信區間為[-?0.4375，0.1290]，斜率 b 的 95%置信區間為[0.9748，1.0732]。考核試劑與參比方法的定量檢測結果（lgcopies/mL）之差在±0.5 范圍內。

綜上所述，申請人考核試劑與參比方法檢測結果一致。

(二)?臨床有效性研究

本研究中分別對考核試劑定量檢測血清 HBV-RNA 用于預測?NAs?治療患者?HBeAg?轉陰、HBV?DNA?低濃度的?CHB?患者中HBV-RNA 的檢出率進行臨床有效性研究。

1.考核試劑定量檢測血清?HBV-RNA 用于預測?NAs?抗病毒治療患者?HBeAg?轉陰研究

采用考核試劑對來源于回顧性隊列樣本的?78?個患者（接受 NAs 抗病毒治療的 HBeAg 陽性慢性 HBV 感染者）的共 624 例血清樣本進行 HBV-RNA 定量檢測，每個患者采集 8 個標本，?分別對應治療前和治療中的 8 個不同檢測點：即 NAs 抗病毒?治療第?0?周、24 周、48 周、1.5 年、2 年、3 年、4 年、5 年。?優選治療第 48 周血清樣本中的 HBV DNA、HBV-RNA 定量值用?于預測治療五年后（一個治療周期）HBeAg 轉陰的受試者工作特征曲線（ROC）分析和這些定量值對 HBeAg 轉陰的預測值分析。

分析結果顯示，NAs 藥物治療的 78 例 HBeAg 陽性患者中，治療 48 周 HBV DNA 定量和 HBV-RNA 定量預測 NAs 藥物治療五年后? HBeAg 轉陰的曲線下面積（AUC）依次為?0.736 和?0.874。

HBV DNA 以 156.0 IU/mL 為閾值獨立預測治療 5 年 HBeAg 轉陰的陽性預測值為 60.9%，陰性預測值為 84.4%；HBV-RNA 以 708 copies/mL 為閾值獨立預測治療 5 年 HBeAg 轉陰的陽性預測值為 80.6%，陰性預測值為 83.3%。HBV-RNA 在治療 48 周后預測五年 HBeAg 轉陰的預測價值優于血清 HBV DNA 的預測價值。

2.?HBV?DNA?低濃度?HBV?感染者中?HBV-RNA?檢出率研究

本次臨床試驗共包含?374?例??HBV?DNA ?低濃度（＜500IU/ml）或未檢出樣本，其中 HBV DNA 陰性 227 例。在 HBV DNA 陰性樣本中，HBV-RNA 檢出陽性 145 例，陽性檢出率為 63.88%（145/227）；在 374 例 HBV DNA＜500IU/mL 的慢性 HBV 感染者樣本中，HBV DNA 檢出陽性 147 例，陽性檢出率 39.30%（147/374），HBV-RNA?檢出陽性? 249 ?例，陽性檢出率66.58%（249/374），χ2=54.26，P＜0.05，具有顯著差異。?可見在 HBV ?DNA 低濃度或未檢出的慢性 HBV 感染者中，HBV-RNA 具有較高的檢出率。?

綜上所述，臨床試驗結果顯示本產品的臨床性能滿足技術審評要求。

四、產品受益風險判定

(一)?受益評估

本產品可用于對乙型肝炎病毒感染的輔助診斷，也可以對 NAs 的治療效果作出預測。我國乙型肝炎患者比較多， NAs 治療可以提高乙型肝炎患者的治愈率，單獨檢測 HBV DNA 可能存在漏檢風險，研究表明，通過對 HBV DNA 已經?檢測不到的患者進行 HBV-RNA 的檢測，可以輔助對患者病情進行監測。

(二)?風險評估

該試劑盒已知和可預見的安全風險主要有以下幾個方面：

1. 與預期用途有關的安全風險，例如本產品的檢測結果非患者病情評價的唯一指標，未結合患者臨床表現和其他實驗室檢測對病情進行綜合分析。

2. 與生產有關的安全風險，例如使用未經過驗證或檢驗不合格的原材料。

3. 與運輸與儲存有關的安全風險，例如試劑的運輸和儲存超出規定條件。

4. 與使用有關的安全風險，例如使用儀器和試劑時沒有按照說明書要求進行操作。

5. ?生物危險，例如直接丟棄使用后或失效的產品或產品使用過程中產生的廢棄物未按照醫療廢棄物統一銷毀處理。

通過對乙型肝炎病毒 RNA（HBV-RNA）測定試劑盒（PCR-?熒光探針法）從生產原材料、配制、檢測、包裝、運輸、儲存、使用方法及安全注意事項、保存和用后處理等全過程危害判定、風險估計、預防化解，從產品技術要求和使用說明書及企業規章制度對產品質量的全過程控制和風險防范措施，已將產品的安全風險系數降到了驗收準則規定的可接受范圍內，同時采取降低風險的措施后沒有引入新的風險。在目前認知水平上，認為該產品上市帶來的受益大于風險。盡管目前認為該試劑盒的受益大于風險，但是為保證用械安全，基于對主要剩余風險的防控，已在該試劑盒說明書中提示以下信息：

1.預期用途：

本試劑盒用于體外定量測定人血清樣本中的乙型肝炎病毒 RNA（HBV-RNA）。

已有研究數據顯示，外周血血清中 HBV-RNA 可反映肝內 HBV 病毒的轉錄活性，在部分血清中 HBV DNA 低于檢測下限?的樣本中，HBV-RNA 仍可以被檢測到。同時，在 NAs 治療中，?血清 HBV-RNA 可輔助作為 HBeAg 轉陰的預測的指標之一，血清 HBV-RNA 結果為陰性，需要結合其他指標共同用于指導 NAs 的治療。該檢測結果不得作為患者病情評價的唯一指標，必須結合患者臨床表現和其他實驗室檢測對病情進行綜合分析。本試劑盒不得用于 HBV 的血液篩查。

2.警示及注意事項：

該試劑盒說明書中明確了該試劑盒檢驗方法的局限性及注意事項。

綜合評價意見

本申報項目為境內第三類醫療器械產品注冊。申請人的注冊申報資料符合現行要求，依據《醫療器械監督管理條例》（國務院令第?680?號）、《體外診斷試劑注冊管理辦法》（原國家食品藥品監督管理總局令第 5 號）等相關醫療器械法規?與配套規章，經系統評價后，建議準予注冊。

2022?年?11?月?10?日

附件：產品說明書